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结直肠癌（ colorectal cancer ， crc ）是常见的消化体系恶性肿瘤，在最新计算的全球癌症发病率和去世率排名中均位居前列 [1] ，其高发病率和高去世率严峻挟制我们的生命安康。 crc 的发生、打开机制凌乱，其间触及多种肿瘤有关基因及肿瘤有关信号通路的改动。
这些年，中药以其多途径、多靶点的优势，在辅佐医治 crc 方面获得了杰出的作用。丹参 赤芍药对是不是可以多靶点、多途径抑制 crc 的发生打开，并运用体外细胞实验对有关靶点进行验证，以期为中医药防治 crc 供给新思路。
1 材料
1.1 细胞
结直肠癌 hct116 细胞购自 atcc 细胞库。
1.2 药材
丹参（批号 20210513 ）、赤芍（批号 20210411 ）均购自北京同仁堂股份有限公司，经天津中医药大学孟静岩教授判定别离为唇形科植物丹参 s. miltiorrhiza bge. 的单调根和根茎、毛茛科植物芍药 p. lactiflora pall. 的 单调根。
根据孟静岩教授多年临床经历，丹参 赤芍活性成分进行判定 [4] ，选择出 18 种丹参特有成分及 11 种赤芍的特有成分，如丹参素、 苯甲酰芍药苷、芍药苷等。
1.3 药品与试剂
mtt （批号 m8180 ）、高效 ripa 裂解液（批号 r0010 ）、 pmsf （批号 p0100) 、蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物（批号 p1261 ）购自北京索莱宝科技有限公司；细胞 / 组织总 rna 获取试剂盒（批号 19221es50 ）、 hifair ⅲ 1st strand cdna synthesis supermix for qpcr （批号 11141es60 ）、 hieff unicon universal blue qpcr sybr green master mix （批号 11184es08 ）购自上海翊圣生物科技有限公司；雌激素受体 1 （ estrogen receptor 1 ， esr1 ）抗体（批号 wl00940 ）、 β-catenin （批号 wl0962a ）、视网膜母细胞瘤基因 1 （ retinoblastoma 1 ， rb1 ）抗体（批号 wl02216 ）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 -3 （ cystein-asparate protease-3 ， caspase-3 ）抗体（批号 wl04004 ）、聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶（ poly-adp-ribose polymerase ， parp ）抗体（批号 wl01932 ）购自沈阳万类生物科技有限公司； hrp 符号的山羊抗兔单克隆抗体（批号 as014 ）、 β-actin 抗体（批号 ac026 ）购自爱博泰克生物技能公司。
1.4 仪器
311 型 co2 细胞培育箱、 mk3 型多功用读板机（美国 thermo fisher scientific 公司）； 5418 型冷冻离心计（德国 eppendorf 公司）； e200 型荧光倒置显微镜（日本 nikon 公司）； chemidoc mp 凝胶成像体系（美国 bio-rad 公司）。
2 办法
2.1 网络药理学分析
2.1.1 丹参 赤芍药对活性成分及靶点选择 经过 tcmsp 数据库（ https://tcmspw.com/tcmsp.php ）检索丹参、赤芍的化学成分，以口服生物利费用（ oral bioavailability ， ob ） ≥ 30% 且类药性（ drug-likeness ， dl ） ≥ 0.18 为条件选择化学成分及对应蛋白靶点，并经过参阅文献进行弥补 [5] 。运用 uniprot （ https://uniprot.org/ ）校正化学成分靶点基因称号，使蛋白质靶点信息标准化 [6] 。
2.1.2 crc 有关基因查找及药物 赤芍药对医治 crc 的潜在靶点。
2.1.3 中药调控网络及蛋白质 潜在靶点”网络。将交集靶点输入到 string 数据库（ https://string-db.org/ ），物种设置为“ homo sapiens ”，最低彼此作用阈值设为最高相信度“ highest confidence （ 0.9 ）”，得到 ppi 网络，再运用 cytoscape 3.8.2 软件将 ppi 网络做可视化处置。运用插件 cytonca 获取网络中得分较高的节点，以介数和安适度的中位数作为截点，将截点之上的靶点视为要害靶点，并进行后续研讨。
2.1.4 基因本体（ gene ontology ， go ）功用及京都基因与基因组百科全书（ kyoto encyclopedia of genes and genomes ， kegg ）通路富集分析 使用 r 软件中 bioconductor 模块软件包“ org.hs.eg.db ”运转完 entrez id 变换。选用 r 软件中的“ colorspace ”“ stringi ”“ ggplot2 ”和“ dose ”“ clusterprofiler ”“ enrichplot ”模块对要害靶基因进行 go 功用和 kegg 通路富集分析，过滤条件为 p ＞ 0.05 ，输出气泡图，分析富集成果。运转“ pathview ”模块制造通路图 [7] 。
2.1.5 潜在活性成分与中心靶蛋白的分子对接 将药物活性成分与要害靶点进行分子对接，首要经过 pubchem 数据库（ http://pubchem.ncbi.nlm.nih. gov/ ）获得化合物的 3d 规划，并使用 open babel 2.3.2 软件将获得的 sdf 文件转化为 pdb 格局。从 pdb 数据库（ http://www.rcsb.org/pdb ）获得要害靶点的 3d 规划 pdb 格局，分子图形体系 pymol 2.5.1 去掉水分子和小分子配体。靶蛋白与化合物均运用 autodocktools 1.5.6 转化为 pdbqt 格局。使用 autodock vina 1.1.2 软件 discovery studio （ ds ， v2016 ）进行对接，对成果进行分析处置，分子对接构象的联系能越低，则联系构象越平稳，反映受体分子与配体之间联系的可以性越大。故对接成果只保存每对分子对接的联系能必定值最高者。
2.2 体外实验验证
2.2.1 mtt 实验 搜集处于对数生长时刻的 hct116 细胞，以 5 × 105/ml 接种于 96 孔板中，细胞贴壁后参加不一样质量浓度（ 125 、 250 、 500 、 1000 、 2000 μg/ml ）的丹参 赤芍溶液，一起设调零孔（不接种细胞不含药物）和对照孔（接种细胞不含药物），置于 37 ℃、 5% co2 的 培育箱中培育 48 h 后，每孔参加 20 μl mtt 溶液（ 5 mg/ml ），轻晃混匀，于 37 ℃、 5% co2 的 培育箱中孵育 4 h 后，弃去上清液，每孔参加 150 μl 二甲基亚砜，轻晃混匀，选用酶标仪测定 490 nm 处的吸光度（ a ）值，核算细胞抑制率。
细胞抑制率＝ [(a 对照 － a 调零 ) － (a 给药 － a 调零 )]/(a 对照 － a 调零 )
2.2.2 划痕实验 将处于对数生长时刻的 hct116 细胞以 1 × 106/ml 接种于 6 孔板中，待细胞贴壁后，用 10 μl 的枪头在孔内划线，用 pbs 缓冲液沿孔壁悄悄冲刷孔底 2 次，吸净细胞残渣，每孔参加 2 ml 不一样质量浓度（ 100 、 200 、 400 μg/ml ）的丹参 赤芍溶液后，置于 5% co2 、 37 ℃培育箱中培育 48 h ，对照组参加不含药物的培育基。培育 0 、 48 h 后，于倒置显微镜下调查并拍摄，运用 image j 软件核算划痕面积。
2.2.3 qrt-pcr 检测 esr1 、黏着联接蛋白 β1 （ catenin beta 1 ， ctnnb1 ）和 rb1 mrna 表达 按“ 2.2.2 ”项下办法处置细胞，依照试剂盒阐明书获取细胞总rna 并组成cdna ，进行qrt-pcr 分析 。 引物序列见表 1 。
2.2.4 western blotting 检测 esr1 、 β-catenin 、 rb1 、 caspase-3 和 parp 蛋白表达 按“ 2.2.2 ”项下办法处置细胞，搜集各组细胞，参加恰当 ripa 裂解液，于冰上裂解，获取细胞总蛋白，于 100 ℃水中加热 5 ～ 10 min 使蛋白变性。蛋白样品经十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至 pvdf 膜，参加 5% 脱脂牛奶，关闭 2 h ，别离参加相应一抗（ 1 ∶ 1000 ），室温孵育 1 h ， 4 ℃过夜孵育；洗膜后，参加二抗（ 1 ∶ 8000 ），室温孵育 1 h ；洗膜后参加 ecl 发光液显色，放置于凝胶成像体系运转程序显影成像，使用 image j 软件分析条带的灰度值。
2.2.5 数据计算 实验数据用 标明，实验重复 3 次，运用 spss 25.0 软件进行计算分析。数据契合正态分布的选用单要素方差分析（ one-way anova ），方差齐的成果用 lsd 查验办法进行组间的比照，方差不齐或不遵守正态分布的用 dunnett’s t3 查验。
3 成果
3.1 丹参 赤芍药对活性成分及靶点的选择
经过在 tcmsp 数据库中查找到丹参 赤芍的活性成分并依照选择条件进行选择，得到活性成分 206 个，药物作用靶基因 352 个。
3.2 crc 有关靶点选择和药物 疾病交集靶点获取
将 genecards 、 omim 、 pharmgkb 、 ttd 、 durgbank 数据库检索的 crc 有关靶点成果兼并，去掉重复数据，选择得到 crc 有关靶点 9143 个，见图 1 。将丹参 赤芍药对的潜在靶点与 crc 有关靶点取交集映射，使用 perl 软件制造韦恩图，共得到 283 个交集靶点，见图 2 。
3.3 “ 中药 活性成分 潜在医治靶点 ” 网络分析
将选择后的丹参 潜在医治靶点”网络图，见图 3 。
3.4 ppi 网络分析
将药物与疾病共有靶点导入 string 数据库，得到 ppi 
网络（图 4 ），共有 131 个节点、 520 条边。
运用插件 cytonca 获取网络中得分较高的节点，以介数和安适度的中位数作为截点，根据条件选择排名前 11 的靶点为 esr1 、 ctnnb1 、 rb1 、特化蛋白 1 （ specialized protein 1 ， sp1 ）、原癌基因 src 、 c-jun 氨基结尾激酶（ c-jun n-terminal kinase ， jun ）、信号传导与转录激活因子 3 （ signal transducer and activator of transcription 3 ， stat3 ）、表皮生长因子受体（ epidermal growth factor receptor ， egfr ）、缺氧诱导因子 -1α （ hypoxia inducible factor-1α ， hif1a ）、周期依靠性激酶抑制剂 1a （ cyclin dependent kinase inhibitor 1a ， cdkn1a ）、细胞周期素 d1 （ cyclin d1 ， ccnd1 ），取排名前 3 的靶点即 esr1 、 ctnnb1 、 rb1 作为要害靶点（图 5 ），进行后续研讨。
3.5 go 功用富集分析
根据 r 言语程序设定条件进行 go 功用富集分 析，富集成果依照 p 值从小到大排序，选择前 10 条 go 条目输出气泡图。如图 6 所示，丹参 赤芍药对首要影响药物反应、氧化应激呼应等生物进程 （ biological process ， bp ），影响膜筏、膜微域等细胞组分（ cellular components ， cc ），参加酰胺联系、肽联系等分子功用（ molecular function ， mf ）。
3.6kegg 通路富集分析
分析药物与疾病一起靶点进行 kegg 通路富集分析，根据 p 值进行排序，得到丹参 蛋白激酶 b （ protein kinase b ， akt ）信号通路、肿瘤坏死因子（ tumor necrosis factor ， tnf ）信号通路、 p53 信号通路、 hif-1 信号通路、细胞凋亡等信号通路上。
3.7 丹参 赤芍活性成分与要害靶点的对接
根据 ppi 分析成果，选择度值排名前 3 的靶基因（ esr1 、 ctnnb1 和 rb1 ）所编码的靶蛋白（ esr1 、 β-catenin 和 rb1 ）与丹参 赤芍药对中活性成分黄芩苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、木犀草素、芍药苷、二没食子酸、异欧前胡素、异隐丹参酮、泪柏醇、鞣花酸等与要害靶点对接平稳（表 2 ）。对成果进一步分析发现，芍药内酯苷与 esr1 联系才能较强，别离在 leu346 、 glu353 、 arg394 构成 h 键，联系能为 ? 67.481 kj/mol ；苯甲酰芍药苷与 β-catenin 联系才能较强，别离在 ser448 、 arg474 构成 h 键，联系能为 ? 37.983 9 kj/mol ；苯甲酰芍药苷与 rb1 联系才能较强，别离在 lys765 、 tyr756 构成 h 键，联系能为 ? 36.384 6 kj/mol （图 8 ）。
3.8 丹参 赤芍药对抑制 hct116 细胞增殖
如表 3 所示，不一样质量浓度的丹参 赤芍进行后续实验。
3.9 丹参 赤芍药对抑制 hct116 细胞搬场
如图 9 所示，与对照组比照，各给药组细胞迁 移率显着降低（ p ＜ 0.05 、 0.01 ），其间丹参 赤芍高剂量组作用最佳。
3.10 丹参 赤芍药对对 hct116 细胞 esr1 、ctnnb1 和 rb1 mrna 表达的影响
如图 10 所示，与对照组比照，丹参- 赤芍药对各剂量组esr1 mrna 表达水黎显着降低（p ＜0.05 、0.01 ），丹参- 赤芍药对高剂量组ctnnb1 mrna 表达水黎显着降低（p ＜0.01 ），丹参- 赤芍药对中、高剂量组rb1 mrna 表达水黎显着升高（p ＜0.05 ）。
3.11 丹参 赤芍药对对 hct116 细胞 esr1 、β-catenin 和 rb1 蛋白表达的影响
如图 11 所示，与对照组比照，丹参 赤芍药对各剂量组 esr1 和 β-catenin 蛋白表达水均匀显着降低， rb1 蛋白表达水黎显着升高（ p ＜ 0.05 、 0.01 ）。
3.12 丹参 赤芍药对 hct116 细胞凋亡蛋白表达的影响
如图 12 所示，与对照组比照，丹参 赤芍药对中、高剂量组 parp 蛋白表达水黎显着降低（ p ＜ 0.05 、 0.01 ）。
4 谈论
中医认为 crc 病位在大肠，与脾胃亲近有关。《灵枢 · 百病始生》说到:“肠胃之络伤，则血溢于肠外，肠外有寒，汁沫与血相抟，则并合凝集不得散，而积成矣。”患者多因脾失健运，血行不畅，日久致瘀，瘀血搏结肠道，损害肠络，日久成痈而致癌肿，常见腹痛拒按、舌质紫暗或有瘀斑、脉涩等临床体现，故临床医治 crc 多参加丹参、赤芍等活血类中 药 [8] 。
本研讨使用网络药理学，深化发掘丹参 赤芍药对抑制 crc 发生打开进程中发扬了要害作用。
go 功用富集分析发现丹参 赤芍药对首要经过 pi3k-akt 信号通路、 tnf 信号通路、 p53 信号通路、 hif-1 信号通路、细胞凋亡等信号通路抑制 crc 的发生打开。其间 pi3k/akt 是与肿瘤发生打开亲近有关的信号通路，在调控 crc 细胞增殖、侵袭、细胞周期等行为上发扬重要的作用。研讨标明， her2 在 crc 癌组织中的高表达水平与 pi3k/akt 通路的激活有关， pi3k 可以驱动 her2 的表达，推进肿瘤干细胞增殖才能 [20] 。杠柳次苷是一种潜在的抗癌化合物，研讨发现杠柳次苷可以经过靶向 pi3k/akt 通路，推进细胞凋亡来发扬抗 crc 作用 [21] 。 tnf-α 是 crc 中常见的促炎细胞因子，可经过激活 jnk 信号通路调度 bap 和 phip 诱导的 crc 上皮细胞 dna 损害。 tnf-α 诱导的 dna 损害又能被功用性 p53 抑制 [22] 。 crc 中增强的糖酵解和磷酸戊糖途径与 hif-1α 表达添加有关，活性氧（ reactive oxygen species ， ros ） / pi3k/akt 和 wnt/β-catenin 信号激活 hif-1α 诱导的代谢重编程，然后在 crc 医治进程中推进机体对 5- 氟尿嘧啶发生耐药性，降低临床作用 [23] 。故 pi3k-akt 信号通路、 tnf 信号通路、 p53 信号通路、 hif-1 信号通路、细胞凋亡等信号通路与 crc 的发生打开亲近有关。
使用分子对接技能选择出丹参 癌”转化进程 [27] ；苯甲酰芍药苷、木犀草素、芍药苷等也具有极好的抗肿瘤活性作用 [28-30] 。
综上所述，本研讨根据网络药理学、分子对接技能及体外实验证明晰丹参 赤芍药对可以经过多通路、多靶点在crc 医治中发扬重要的作用，为丹参- 赤芍药对医治crc 供给了客观根据。
利益冲突 一切作者均声明不存在利益冲突
参阅文献（略）
来 源:王方园，王 栋，孔宪斌，时浩洋，赵 爽，杨玉莹，孟静岩．根据网络药理学和分子对接研讨丹参-赤芍药对医治结直肠癌的作用机制 [j]. 中草药, 2022, 53(18): 5731-5741 .
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